Противораковые исследования (2013) (GC белок)

Дегалактозилированная/дезиалилированная человеческая сыворотка, содержащая Gc-фактор активации макрофагов, индуцирует фагоцитарную активность макрофага и активность противоопухолевого действия в организме (in vivo)

ДАИСУКЕ КУЧИИКЕ1,2, ЙОШИХИРО УТО1, ХИРОТАКА МУКАИ1, НОРИКО ИШИЯМА1, ЧИАКИ АБЕ1, ДАИЧИ ТАНАКА1, ТОМОХИТО КАВАИ1, КЕНТАРО КУБО2, МАРТИН МЕТТЕ3, ТОШИО ИНУИ1,2,3,4, ЙОШИО ЭНДО5 И ХИТОШИ ХОРИ1

Аннотация. Общие сведения: специфический для группы компонент, дериват белка, фактор активации макрофагов (GcMAF), имеет различные биологические активности, такие как активация макрофагов и противоопухолевая активность. Клинические исследования GcMAF были проведены для метастатического рака молочной железы, рака предстательной железы и метастатического колоректального рака. В данном исследовании, несмотря на сложный процесс очистки GcMAF, мы использовали ферментативно обработанную человеческую сыворотку, содержащую GcMAF со значительной макрофагально-стимулирующей активностью и противоопухолевой активностью. Результаты. Мы обнаружили GcMAF в дегазактозилированной/ десалилированной человеческой сыворотке методом вестерн-блоттинга с использованием антитела человеческого Gc-глобулина и лектина Helix pomatia агглютинин. Мы также обнаружили, что содержащая GcMAF человеческая сыворотка значительно усиливает фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мыши и увеличивает время выживания мышей, имеющих асцитную опухоль Эрлиха. Вывод. Мы продемонстрировали, что человеческую сыворотку, содержащую GcMAF, можно использовать в качестве потенциального активатора макрофагов для иммунотерапии рака.

Ключевые слова: дегалактозилированная/десалилированная человеческая сыворотка, GcMAF, фагоцитарная активность макрофагов, противоопухолевая активность в организме (in vivo).

Группоспецифический компонент (Gc) белок, также известный как витамин D-связывающий белок (DBP) или Gc глобулин, представляет собой человеческий плазмидный гликопротеин (1), равный 53 кДа. Воспаление приводит к гидролизу терминальной галактозы и сиаловой кислоты белка Gc, и это опосредуется связанной с мембраной β-галактозидазой, присутствующей на активированных B-клетках и сиалидазе на Т-клетках, для продуцирования Gc-белкового макрофагационно-активирующего фактора (GcMAF) (2). Было выявлено, что GcMAF обладает несколькими биологическими активностями, такими как активация макрофага через генерацию супероксида (3, 4) и фагоцитарная активация (5), эффект анти-ангиогенеза (6,7) и противоопухолевая активность (8-10). Кроме того, было продемонстрировано, что применение GcMAF имеет клинические преимущества для пациентов с метастатическим колоректальным, метастатическим раком молочной железы и раком предстательной железы и для неанемических ВИЧ-инфицированных пациентов (11-14).

Однако основная проблема связана с очисткой GcMAF для клинического использования. В предыдущих исследованиях GcMAF очищали из человеческой сыворотки используя колонку для проведения хромотографии, модифицированную 25-гидрокси-витамином D3 (15). Тем не менее, трудно предотвратить загрязнение, когда колонка неоднократно используется. Кроме того, очищенный GcMAF нестабилен в присутствии кислорода при комнатной температуре и в отсутствие антиоксидантов, таких как альбумин и мочевая кислота, которые обильно присутствуют в крови (16). Чтобы преодолеть проблемы, связанные с очисткой GcMAF, мы приготовили неочищенный GcMAF с использованием аутологичной сыворотки в качестве источника. Таким образом, мы предлагаем новый метод получения аутологичной сыворотки, содержащей GcMAF, путем дегалактозилирования и десалилирования и сообщаем о потенциальной роли аутологичного GcMAF в стимуляции фагоцитоза в макрофагах и противоопухолевой активности в организме.

Материалы и методы. Получение GcMAF-содержащей человеческой сыворотки. Был получен Gc белок и GcMAF, как ранее сообщалось Уто и др. (17, 18). Человеческая сыворотка, содержащая 1f1f-подтип Gc белка (100 мкл, 100 Мкг/мкл) была получена из человеческого организма добровольцев, и каждый образец сыворотки инкубировали с 65 мМ β-D-галактозидазы (из Кишечная палочка (Escherichia coli), Вако, Осака, Япония) и нейраминидазы (сиалидазы, из Энтеритная клостридия (Clostridium perfringens), Sigma-Aldrich Japan Co. Ltd., Токио, Япония) в 100 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7,0) при температуре 37°С в течение 3 часов. Реакционную смесь нагревали при 60°С в течение 10 мин и раствор сгустили, используя микроконцентратор (10000 НОММ, Nihon Millipore Co. Ltd., Токио, Япония). Концентрации белка определяли, используя набор для анализа оценки биосовместимости белкового спектра (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA). Вестерн-блоттинг человеческой сыворотки, содержащей GcMAF. Готовую человеческую сыворотку, содержащую GcMAF, подвергали электрофорезу в додецилполиакриламидном геле (ДНС-ПААГ) в восстанавливающих условиях и затем разделяли электрофорезом на нитроцеллюлозной мембране. Неспецифическое связывание блокировали путем инкубации в течение ночи в ТРИС-буферизированном физрастворе (рН 7,4), содержащем 0,1% полиоксиэтиленсорбитана монолаурат (Tween 2)0 и 1% альбумина бычьей сыворотки (BSA) при температуре 4°С. Затем мембраны зондировали античеловеческим глобулином Gc (DakoCytomation Co. Ltd., Киото, Япония) и биотин-конъюгированным лектином Helix pomatia агглютинин (HPA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Миссури, США), специфичным для GcMAF фрагментом молекулы N-ацетилгалактозамина (GalNAc). После промывки мембраны блоты инкубировали антикроличьим иммуноглобулином класса G в качестве вторичного антитела, меченого хреносодержащей пероксидазой (HRP) (GE Healthcare Life Sciences, Уппсала, Швеция). Блоты были разработаны с использованием системы ЭХЛ--обнаружения вестерн-блоттинга (GE Healthcare Life Sciences, Уппсала, Швеция), а визуализация и количественная оценка полос вестерн-блоттинга проводилась с помощью анализатора хемилюминесценции LumiCube и программного обеспечения JustTLC для анализа изображений (Liponics, Токио, Япония).

--

Signal intensity of 55 kDa protein - Интенсивность сигнала 55 кДа белка

Рисунок 1. Анализ группоспецифического компонента белкового фактора активации макрофага, (GcMAF), генерируемого ферментативной обработкой человеческой сыворотки. A: Вестерн-блоты, зондированные античеловеческим глобулином Gc и лектином Helix pomatia agglutinin (HPA). B: Количественная оценка интенсивности сигнала обнаруженных белковых зон проводилась с использованием программного обеспечения JustTLC для анализа изображений.

Выделение и культивирование перитонеальных макрофагов мышей. Перитонеальные адгезивные клетки мышей, содержащие макрофаги, отбирали у 8-недельных женских особей ICR-мышей (Japan SLC, Хамамацу, Япония), как сообщалось ранее Уто и др. (17, 18) и культивировали в 24-луночных планшетах с плотностью 5×105 клеток/лунок в бессывороточном RPMI-1640 растворе (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США) в течение 1 часа. Культивированные клетки затем три раза промывали в бессывороточном RPMI-1640 растворе для отделения адгезивных макрофагов от неадгезивных клеток, таких как Т- и В-клетки. Культивированные макрофаги обрабатывали различными концентрациями сывороточных белков в течение 15 часов и использовали для анализа фагоцитоза, как описано ниже.

Анализ фагоцитоза. Перитонеальные макрофаги мыши наносили на покровные стекла в 24-луночном планшете. Через 3 часа обработки человеческой сывороткой, проводился анализ культур на фагоцитарную активность. Овечьи эритроциты (SRBCs, Nippon Bio-Supp. Center, Токио, Япония) были опсонизированы кроличьей гемолитической сывороткой (анти-овечьи эритроциты Cosmo Bio Co., Токио, Япония). Опсонизированные в бессывороточном растворе RPMI-1640 овечьи эритроциты (0,5%) перекладывали на каждое покрытое макрофагом покровное стекло и культивировали в течение 1,5 часа. Неиннициализированные эритроциты лизировали путем погружения покровного стекла в гипотонический раствор [1/5-разбавленный фосфатно-буферный солевой раствор (PBS)]. Макрофаги фиксировали метанолом, высушивали воздухом и окрашивали красителем Гимза. Количество фагоцитированных эритроцитов на клетку определяли микроскопически; 250 макрофагов подсчитывали для каждой точки данных. Данные выражались в виде индекса фагоцитоза (PI), который определялся как процент макрофагов с поглощенными эритроцитами, умноженный на среднее количество поглощенных эритроцитов на макрофаг.

Животные. Самки мышей ICR, весом 20-25 г, размещали в клетках из поликарбоната в стандартных лабораторных условиях (24±1°C, 12 часов светлого/темного цикла) с пищей и водой по желанию (ad libitum). Все процедуры, используемые для экспериментов на животных, были одобрены Комитетом исследований животных Университета Токусимы (TokuDobutsu12025). Клетки асцитной карциномы Эрлиха (EAC) были получены в Исследовательском институте рака Университета Канадзавы и поддерживались в брюшной полости мышей путем инъекции 0,1 мл асцитической жидкости каждые семь дней. Подсчеты ацитовых опухолевых клеток проводились в гемоцитометре Нойбауэра с использованием метода исключения трипанового синего красителя. Взвеси опухолевых клеток подготавливались в ФСБ.

Анализ противоопухолевой активности в организме. Десятинедельным самкам мышей ICR инокулировали 1×107 клеток асцитной карциномы Эрлиха (EAC) (0,2 мл/мышь) внутрибрюшинно (интраперитонеально). День имплантации опухоли обозначался как день '0'. В первый день животных отбирали в случайном порядке и разделяли на пять групп (n = 5) и вводили интраперитонеально ФСБ (фосфатно-солевой раствор), GcMAF (40 нг/кг/сут) или человеческую сыворотку, содержащую GcMAF (172, 517 и 1552 мкг белка/кг/сут) в течение семи дней. Животных с асцитической опухолью взвешивали каждый день. Кривые выживаемости Каплана-Мейера анализировали с помощью логарифмического теста.

Статистический анализ. Данные выражаются в виде среднего и стандартного отклонения. Статистическая значимость различий между результатами независимых экспериментов была проанализирована с использованием критерия Стьюдента. Значение p< 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты. Приготовление и характеристика человеческой сыворотки, содержащей GcMAF. Мы получили 8,8 мг сывороточного белка из 100 мкл здоровой человеческой сыворотки путем дегалактозилирования/десалилирования и концентрации с использованием микроконцентратного центрифужного фильтра. На рисунке 1А показан вестерн-блотт дегатактозилированной/десалилированной человеческой сыворотки. Четыре зоны (70 кДа, 55 кДа, 51 кДа и 17 кДа) были обнаружены на блот-мембранах с использованием лектина HPA, который распознает фрагмент молекулы N-ацетилгалактозамина (GalNAc). Поскольку белковая зона 55 кДа была специфически обнаружена с помощью античеловеческого глобулина Gc, было подтверждено, что GcMAF присутствует в дегалактозилированной/десалилированной человеческой сыворотке. Интенсивность сигнала белка 55 кДа была значительно выше, чем та же в контрольной сыворотке, как показано на рис. 1В. Поэтому было четко продемонстрировано, что дегалактозилирование/десалилирование человеческой сыворотки является полезным методом для получения GcMAF.

--

Phagocytic Index - Индекс фагоцитоза

Рисунок 2. Фагоцитарная активность мышиных перитонеальных макрофагов, наблюдаемых с использованием ферментативно обработанного белка человеческой сыворотки (А) или сывороточного белка (В). Все эксперименты проводились трижды. Каждая планка ошибки представляет собой стандартное отклонение. Число на каждой планке указывает среднее значение. *р <0,05.

Стимулирующая активность человеческой сыворотки содержащей GcMAF по фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов мыши. Мы исследовали фагоцитарную активацию, используя человеческую сыворотку, содержащую GcMAF, относительно мышиных перитонеальных адгезивных клеток, содержащих макрофаги. На рисунке 2А показана значительная фагоцитарная активация от 1 до 1000 нг человеческой сыворотки содержащей GcMAF, по сравнению с контрольной. Максимальный индекс фагоцитоза (PI) 1,73 для 10 нг GcMAF-содержащей человеческой сыворотки соответствовал концентрации в сыворотке 10 нг GcMAF (PI=1,59). Фагоцитарная активация не проявилась в перитонеальных макрофагах, инкубированных с помощью необработанной человеческой сыворотки (рис. 2В).

Противоопухолевая активность в организме GcMAF-содержащей человеческой сыворотки по модели EAC. На рис. 3 показана противоопухолевая активность GcMAF-содержащей человеческой сыворотки относительно инокулированной интраперитонеально асцитной карциномы Эрлиха (EAC) мышам. Лечение мышей, содержащих EAC, дозой 1,552 мкг белка/кг человеческой сыворотки, содержащей GcMAF, привело к значительному продлению срока жизни, а значение [лечения/контроля (Л/К) (%)] составило 138% по сравнению с мышами контрольной группы, содержащих EAC.

--

Survival ratio - Доля выживших организмов

Рисунок 3. Противоопухолевая активность в организме оценивалась с использованием ферментативно обработанного человеческого сывороточного белка и Gc-белкового макрофага-активирующего фактора (GcMAF). Все эксперименты проводились трижды. Каждая планка ошибок представляет собой стандартное отклонение. Число на каждой планке указывает среднее значение. *р <0,05.

Обсуждение.

Мы приготовили человеческую сыворотку, содержащую GcMAF, с помощью обработки человеческой сыворотки β-галактозидазой и сиалидазой, а затем проанализировали ее способность активировать фагоцитоз перитонеального макрофага и ее противоопухолевую активность в организме. Вестерн-блот-анализ с использованием лектина HPA показал четыре положительные зоны, в том числе GcMAF-положительную зону. На основе молекулярной массы других трех зон (70 кДа, 51 кДа и 17 кДа) мы предположили, что зонами могут быть гликопротеины сыворотки, α1Тгликопротеин (75 кДа), тяжелая цепь иммуноглобулина (Ig) (5070 кДа) и Α1-антитрипсин (51 кДа). Однако сообщалось, что α1T-гликопротеин не имеет фрагмента N-ацетилгалактозамина (GalNAc) (19). Следовательно, зона 70 кДа может представлять собой тяжелую цепь IgA или IgD с O-сцепленными олигосахаридами, которые состоят из GalNAc, галактозы и сиаловой кислоты с тем же составом углеводной цепи, что и белок Gc. IgA является наиболее распространенным иммуноглобулином в крови, а плазма здорового взрослого человека содержит около 90-400 мг/дл иммуноглобулинов. Кроме того, в плазме содержится около 3-5 мг/дл белка Gc.

FcαRI (или CD89), Fc-рецептор IgA, синтезируется на иммунных эффекторных клетках и инициирует воспалительные реакции (20, 21). Кроме того, было продемонстрировано, что количество N-ацетилгалактозамина (GalNAc), присоединенного к IgA O-сцепленным гликанам, было значительно снижено у пациентов с болезнью Крона и сильно связано с клинической активностью (22). Эти данные свидетельствуют о том, что GcMAF, а также IgA активируется N-ацетилгалактозамином (GalNAc), который представлен обработкой β-галактозидазой и сиалидазой. Если эта гипотеза верна, она может объяснить механизмы, при которых 10 нг сывороточного белка, содержащего GcMAF, индуцировали фагоцитарную активацию, сравнимую с 10 нг очищенного GcMAF.

Дефицит IgA также представляет интерес для нас; это наиболее распространенное нарушение, связанное с иммунным дефицитом (23). Люди с этим нарушением имеют низкий уровень или отсутствие IgA, которое влияет на правильное функционирование иммунной системы и увеличивает случаи бронхита, конъюнктивита (глазной инфекции), воспаления желудочно-кишечного тракта, включая язвенный колит, болезнь Крона и инфекции верхних дыхательных путей (23, 24). Имеет ли дефицит IgA последствия для эндогенного уровня GcMAF, еще предстоит выяснить. Кроме того, интерес представляет экзогенное лечение GcMAF людей с изолированной недостаточностью IgA-типа. Для выяснения того, присутствуют ли в человеческой сыворотке активные гликопротеины, помимо GcMAF, необходимы дополнительные исследования.

В заключение мы делаем предположение о том, что человеческая сыворотка, содержащая GcMAF, может быть использована в качестве эффективного активатора фагоцитоза для макрофагов и противоопухолевого агента при иммунотерапии рака.

Выражение признательности

Мы благодарим сотрудников Центра медицинских услуг Университета Токусимы за сбор образцов крови у здоровых добровольцев.

 

Список литературы

1 Дайгер С. П.: Группоспецифические компонентные белки (Gc) связывают витамин D и 25-гидроксивитамин D. Заседание Национальной академии наук США 72: 2076-2080, 1975.

2 Ямамото Н. и Кумаширо Р.: Преобразование связывающего белка витамина D3 (группоспецифического компонента) в фактор активации макрофагов путем ступенчатого действия бета-галактозидазы В-клеток и сиалидазы Т-клеток. J Immunol 151: 2794-2802, 1993.

3 Ямамото Н., Линдсей Д.Д., Нарапарайю В.Р., Ireland RA и Popoff SN: дефект в каскаде активации макрофага, вызванном воспалением, у остеопротетических крыс. J Immunol 15: 51005107, 1994.

4 Мохамад С.Б., Нагасава Х., Уто Й. и Хори Х.: Приготовление Gc-белкового фактора активации макрофага (GcMAF), а также его структурная характеристика и биологическая активность. Противораковые исследования 22: 4297-4300, 2002.

5 Нагасава Х., Саасаки Х., Уто Й., Кубо С. и Хори Х.: Связь предшествующего действия фактора активации макрофага (GcMAF) с полиморфизмом в витамин D-связывающем белке. Противораковые исследования 24: 3361-3366, 2004.

6 Канда С., Мочицуки Й., Мийата Й., Канетаки Х. и Ямамото Н.: Влияние витамина D3-связывающего белкового фактора активации макрофага (GcMAF) на ангиогенез. J Национальный институт рака 94: 1311-1319, 2002.

7 Кискер О., Оницука С., Бекер C.M., Фаннон М., Флинн Е, Д'Амато Р., Зиттер Б., Фолкман Дж., Рей Р., Свами Н. и Пири-Шепард С.: Витамин D-связывающий белковый фактор активации макрофага (DBPmaf) ингибирует ангиогенез и рост опухоли у мышей. Neoplasia 5: 32-40, 2003.

8 Кога Й., Нарапарайю В.Р., и Ямамото Н.: Противоопухолевое действие витамина D-связывающего белка, вызывающего фактор активации макрофага на асцитные опухоли Эрлиха у мышей. Proc Soc Exp Biol Med 220: 20-26, 1999.

9 Мохамад С.Б., Нагасава Х., Саасаки Х., Уто Й., Накагава Й., Кавашима K и Хори Х.: Gc-белковый фактор активации макрофага (GcMAF): изоэлектрическая фокусирующая картина и опухолевая активность. Противораковые исследования 23: 4451-4457, 2003.

10 Нонака K., Оницука С., Ишибаши Х., Уто Й. и Хори Х., Накаяма Т., Матсуура Н., Канематсу Т., Фуджйока Х.: Витамин D3-связывающий белковый фактор активации макрофага ингибирует ГЦК у мышей с ТКИД. J Surg Res 172: 116-122, 2012.

11 Ямамото Н., Суяма Х., Наказато Х., Ямамото Н. и Кога Й.: Иммунотерапия метастатического колоректального рака при помощи витамин D3-связывающего белкового фактора активации макрофага, GcMAF. Иммунология и иммунотерапия рака 57: 1007-1016, 2008.

12 Ямамото Н., Суяма Х., Ямамото Н., и Ушийима Н.: Иммунотерапия пациентов с метастатическим раком молочной железы с помощью витамин D3-связывающего белкового фактора активации макрофага (GcMAF). Int J Cancer 122: 461-467, 2008.

13 Ямамото Н., Суяма Х. и Ямамото Н.: Иммунотерапия рака предстательной железы с Gc-белковым фактором активации макрофага GcMAF. Transl Oncol 1: 65-72, 2008.

14 Ямамото Н., Усихима Н. и Кога Y: Иммунотерапия ВИЧ-инфицированных пациентов с помощью Gc-белкового фактора активации макрофага (GcMAF). J Med Virol 81: 16-21, 2009.

15 Свами Н., Рой A., Чанг Р., Бриссон М. и Рэй Р.: Аффинная очистка человеческого витамин D-связывающего белка. Protein Expr Purif 6: 185-188, 1995.

16 Амес Б.Н., Каткарт Р., Швиерс E. и Хокштейн P.: Мочевая кислота обеспечивает антиоксидантную защиту у людей от окислительно-радикального старения и рака: Гипотеза. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6858-6862, 1981.

17 Уто Й., Ямамото С., Такеучи Р., Накагава Й., Хирота K., Терада Х., Оницука С., Наката Е. и Хори Х.: Влияние Gc-производного исходного вещества фактора активации макрофага (PreGcMAF) на фагоцитарную активацию мышиных перитонеальных макрофагов. Противораковые исследования 31: 2489-2492, 2011.

18 Уто Й., Ямамото С., Мукаи Х., Ишияма Н., Такеучи Р., Накагава Й., Хирота K., Терада Х., Оницука С., и Хори Х.: Применение β Галактозидаза - это обычная модификация первой ступени из трех основных подтипов белка Gc в GcMAF. Противораковые исследования 32: 2359-2364, 2012.

19 Араки T., Хаупт Х., Херментин П., Швик Х.Г., Кимура Й., Шмид К. и Ториката Т.: Подготовка и частичная структурная характеристика α1T-гликопротеина из нормальной плазмы человека. Arch Biochem Biophys 351: 250-256, 1998.

20 Мортон Х.К., ванн Эгмонд М. и ванн де Винкел Дж.Г.: Структура и функция рецепторов IgA Fc человека (Fc альфа R). Crit Rev Immunol 16: 423-440, 1996.

21 Сноек В., Петерс И. и Кокс Е.: Система IgA: сравнение структуры и функции у разных видов. Vet Res 37: 455467, 2006.

22 Иноуэ Т., Ииджима Х., Таджири M., Шинзаки С., Шираиши Е., Хияма С., Мукаи A., Накаджима С., Иватани Х., Нишида Т., Мицушима Т., Ясуи Т., , Исака Й., Канто Т., Цуджии M., Мийоши Е., Вада Й. и Такехара Т.: Дефицит N-ацетилгалактозамина в O-сцепленных олигосахаридах IgA является новым биологическим маркером болезни Крона. Inflamm Bowel Dis 18: 1723-1734, 2012.

23 Hammarström L, Vorechovsky I и Webster D: Селективный дефицит IgA (SIgAD) и общий переменный иммунодефицит (CVID). Clin Exp Immunol 120: 225-231, 2000.

24 Йел Л.: селективный дефицит IgA. J Клинческая иммунология 30: 10-16, 2010.

СМОТРИТЕ ТАКЖЕ: