Белок GCMAF и морфология макрофагов

Клиническое применение белка GcMAF и молозива GcMAF

Вступление к исследованию GcMAF - Факторы активации макрофагов из Gc-белка

--
  • Что такое GcMAF?
  • 4 типа GcMAF:
  • Новости пероральной терапии GcMAF?
  • Отличия перорального GcMAF от сыворотки GcMAF
  • Где применяется GcMAF?

В данной презентации мы обсудим макрофаги и определим разные типы Факторов активации макрофагов из Gc белка (GcMAF), предложенные нашей клиникой, особенно наш GcMAF второго поколения, существующее новое пероральное молозиво MAF, а также их использование в клинических условиях, таких как лечение рака, инфекционных заболеваний, омоложения кожи, стимуляции роста волос, лечении аллергии, синдрома хронического переутомления, рассеянного склероза и ревматоидного артрита.)

Что такое Gc-белок?

Белковая структура GcMAF
Белковая структура GcMAF
Verboven C. et al., Nat. Struct. Biol., 9, 131-136, 2002. Bogani F.et al., J. Am. Chem. Soc., 128, 7142-7143, 2006.
  • Группоспецифический компонентный белок, Известный как витамин D-связывающий фактор
  • Порядка 56 мДа гликопротеина присутствует в плазме крови человека
  • Член надсемейства белков
    • Белок-носитель витамина D
    • Нейтрализатор актина
    • Исходный материал фактора активации макрофагов (GcMAF)

*Давайте поговорим об основных моментах касательно Gc-белка и GcMAF. Итак, что такое Gc белок? Gc-белок – гликопротеин, известный как витамин связывающий фактор. Порядка 56 кДа гликопротеина присутствует в сыворотке человека. Принадлежит надсемейству белков.

 

Gc-белок является носителем витамина D и нейтрализует G-актин, выделяющийся при клеточном лизисе. Gc-белок является исходным материалом фактора активации (GcMAF)

(Имеются шесть основных подтипов G-белка, включая гомодимеры и гетеродимеры Gc1f, Gc1s, и Gc2.  Доктор Ямамото и доктор Хори использовали образцы крови для производства GcMAF с подтипом Gc 1f1f. Это одна из причин, по которой Gc 1f1f используется при лечении различных заболеваний. Наши данные по фагоцитарной активности показывают, что GcMAF, полученный из всех подтипов, обладает высокой активностью. На данной схеме показано, что Gc1s имеет три различных структуры сахаров, предложенные различными исследователями.)

Шесть основных типов Gc-белка

Генотип : Gc1f, Gc1s и Gc2

 Фенотип : Гомодимеры и гетеродимеры Gc1f, Gc1s и Gc2, Gc1f1f, Gc1f1s, Gc1f2, Gc1s1s, Gc1s2 и Gc22

GcMAF получают из всех фенотипов с высокой фагоцитарной активностью

Представлены шесть основных подтипов Gc-белка, включая гомодимеры и гетеродимеры Gc1f, Gc1s, и Gc2. Доктор Ямамото и доктор Хори использовали образцы крови для производства GcMAF с подтипом Gc 1f1f. Это одна из причин, по которой Gc 1f1f используется для лечения различных заболеваний. Наши данные по фагоцитарной активности показывают, что GcMAF, полученный из всех подтипов, обладает высокой активностью. На данной схеме также показано, что у Gc1s есть три различных структуры сахара, представленные из разных исследований.

Предложенная схемаКонверсия Gc1f протеина в GcMAF

  • Результаты воспаления в гидролизе конечной галактозы и сиаловой кислоты протеина Gc1f1f
  • Гидролиз опосредуется мембранно-связанной β-галактосидазой активированных B-клеток и сиалидазы Т-клеток.
--
N. Yamamoto, et al., J. Immunol., 151, 2794-2802, 1993.


Это предложенная схема конверсии белка Gc1f в GcMAF от Доктора Ямамото и Доктора Хори Университета Токушима в 1993 году.

Мы продемонстрировали, что результаты воспаления в гидролизе терминальной галактозы и сиалиевой кислоты Gc1f1f. Гидролиз опосредуется мембранно-связанной β-галаксидазой, присутствующей в активированных  B-клетках и сиалидазой в T-клетках. Наконец, образуется GcMAF.

Морфология макрофагов

Адгезивный макрофаг (периферическая кровь). Universitätsklinik Ulm
Адгезивный макрофаг (периферическая кровь). Universitätsklinik Ulm



Макрофагам не хватает клеток крови

Они поглощают бактерии и направляются к клеткам

Передвижение происходит как у амеб

Обязательно присутствуют во всех тканях

По представлениям людей (часто) макрофаги представляют собой «голодные» белые кровяные тельца, которые поглощают бактерии и прочие патогены, передвигающихся как амебы. Макрофаги присутствуют во всех тканях.

Функции макрофагов

Макрофаг мыши, расправляющий «руки» " (pseudopodia) для поглощения двух частиц, возможных патогенов. Wikipedia
  • фагоцитозная: определение, поглощение и уничтожение патогенов;
  • устранение умирающих или отмерших клеток и продукты распада клеток;
  • очистка изношенных клеток и продуктов распада;
  • критическая роль для адаптивного иммунитета;
  • лечение ран, восстановление тканей и регенерация.

У макрофагов имеются очень важные функции, такие как фагоцитоз патогенов, удаление отмерших или отмирающих клеток, очистка продуктов распада клеток. 

Они играют важную роль для адаптивного иммунитета, лечения ран, восстановления тканей и регенерации.

Сегодня я хотел бы отметить важность восстановления тканей и регенерации клеток посредством клинических исследований, которые мы представим позднее.

Морфология макрофагов

  1. Поглощение через фагоцитоз.
  2. Образование фагосом.
  3. Патогены разрушаются посредством энзимов.
  4. Отторжение отработанного материала.

У макрофагов есть удивительное свойство определять, поглощать и уничтожать патогены, как показано на схеме.

Исследование фагоцитоза при помощи GcMAF второго поколения. Стрелки указывают на клетки, поглощенные макрофагами.

Макрофаги тканей

  • На данной схеме показано существование макрофагов практически во всех тканях тела, например, в мозгу, в коже, легких, кишке, и т.п.
  • Макрофаги, присутствующие в тканях, играют критическую роль в восстановлении и регенерации.

Шаги активации макрофагов (Согласно предположению доктора Инагавы)

Концепт заключается в том, что макрофаги могут быть представлены в 3 состояниях – активированном состоянии, подготовленном состоянии, а также в состоянии устаревших или подверженных стрессу клеток.

 

GcMAF терапия поддерживает макрофаги в подготовленном активном состоянии, готовом к действию против патогенов, без образования большого количества цитокинов или воспаления.

Биологическая активность GcMAF

Испытание фагоцитоза с вторым поколением GcMAF. Фото, университет Токушима

Макрофаги играют важную роль в антиопухолевой активности

В целом считается, что GcMAF повышает фагоцитозную активность, генерацию супероксидных радикалов, обладает анти-ангиогенным эффектом, оказывает антиопухолевый эффект.

Не так давно мы заметили, что GcMAF также повышает количество моноцитов в крови и повышает скорость созревания дендритных клеток в лабораторных условиях.

Дендритные клетки (DCs) + GcMAF второго поколения

Повышенная скорость созревания в лабораторных условиях

Отображение дендритных клеток (DCs) из нормальной периферической крови, без использования и с использованием GcMAF второго поколения, после 6 и 8 дней культивации.

*На данной схеме показано отображение количества дендритных клеток, полученных из нормальной периферической крови, без использования и с использованием GcMAF второго поколения после 6 и 8 дней культивации. Из данного эксперимента вы видите, что GcMAF второго поколения повышает скорость созревания дендритных клеток в лабораторных условиях.

Биологическая активность GcMAF

GcMAF второго поколения
GcMAF второго поколения
Молозиво GcMAF
Молозиво GcMAF

GcMAF протестирован на фагоцитозную активность макрофагов при помощи макрофагов мышей и красных кровяных телец овцы, в университете Токушима.

GcMAF второго поколения обладает очень высокой активностью.

Молозиво GcMAF характеризуется высокой фагоцитозной активностью макрофагов, эквивалентной 100 нг GcMAF первого поколения.

Стабильность GcMAF второго поколения

2.5мл GcMAF
2.5мл GcMAF

2.5мл GcMAF

Температура

Стабильност

4 °С (в холодильнике)

> 1 года

< -18 °С (в холодильнике)

> 5 лет

20 °С (комнатной температуры)

4 недели

40 °С

1 неделя

GcMAF второго поколения очень стабилен, и сохраняет максимальную активность в течение 1 года в замороженном состоянии, до 4 недель при комнатной температуре, и до 7 дней при 40 градусах Цельсия.

Что такое GcMAF для перорального применения?

--

GcMAF получают из молозива коровы.

Не требуется кровь для производства перорального GcMAF.

Молозиво схоже с сывороткойсодержит большое количество белка, а также иммуноглобулинов класса G, A и M.

Не требует инъекций.

Пероральное введение – удобство применения.

В Японии классифицирован как пищевой.

Фагоцитозная активность перорального GcMAF на основе макрофагов кишечника мыши

Пероральный GcMAF активирует фагоцитоз макрофагов кишечника мыши

Сыворотка (1 мг/кг)
Сыворотка (1 мг/кг)
Сыворотка GcMAF  (1 мг/кг)
Сыворотка GcMAF  (1 мг/кг)
Молозиво (1 мг/кг)
Молозиво (1 мг/кг)
Пероральное молозиво MAF (1 мг/кг)
Пероральное молозиво MAF (1 мг/кг)

Это эксперимент, проведенный доктором Уто в Университете Токушима.

Пероральное молозиво GcMAF активирует фагоцитоз макрофагов кишечника мыши.

Примерно на том же уровне, что LPS (липосахарид).

Это означает, что GcMAF из молозива отлично подходит для активации макрофагов в кишечнике млекопитающих.

Выработка цитокинов перитонеальными макрофагами мыши

IL-1β и TNF-α являются основными воспалительными цитокинами, которые вызывают аутоиммунные заболевания.

Пероральный GcMAF не вызывает образование цитокинов такого типа.

(Применение нашего перорального MAF не приведет к образованию подобных про-воспалительных цитокинов.)

Эксперименты с пероральным GcMAF на здоровых собаках

0.02 мг/10 кг/день, op, 3 недели
0.02 мг/10 кг/день, op, 3 недели
Пероральный GcMAF стимулирует повышения Т-хелперов и Т-киллеров у здоровых собак.

Данный эксперимент был проведен доктором Осаки в университете Тоттори.

В предварительном эксперименте пероральный GcMAF стимулирует повышение количества Т-хелперов и Т-киллеров у здоровых собак.

Th2 цитокины Испытание перорального GcMAF на здоровых собаках

Пероральный GcMAF сокращает выработку IL-4 и IL-6.

Эти цитокины Th2 отвечают за аллергические заболевания

В данном предварительном эксперименте, Пероральный GcMAF сокращает выработку IL-4 и IL-6.

Цитокины Th2 ассоциируются с аллергическими заболеваниями.

Сравнение 4 типов GcMAF

Колонка витамина D3 для производства GcMAF первого поколения

GcMAF 1го поколения

  • GcMAF 1го поколения
  • Разработан Доктором Ямамото в 1991 году
  • Низкая концентрация (100 нг/0.25 мл, 1 доза)
  • Низкая стабильность при комнатной температуре
  • Химически изолировано (очищено), процесс стерилизации при использовании
    системы фильтрации 0.22 μm
  • 25-(OH) Витамин D3 колонка для хроматографии
  • Колонка для хроматографии по сродству при постоянном использовании вызывает риск заражения; необходимо утилизировать

 

GcMAF 2 поколения 

GcMAF 2го поколения

  • Разработан университетом Токушима в 2010
  • Высокая концентрация (1500 нг/0.5 мл, 1 доза)
  • Значительная высокая стабильность и способность к активации макрофагов  
  • Стерилизация с использованием системы фильтрации 0.22 μm
  • Новый запатентованный процесс производства

GcMAF второго поколения был разработан Университетом Токушима в 2010. Преимущества GcMAF второго поколения – высокая концентрация (1500 нг/0.5 мл на дозу), а также значительная высокая стабильность и способность к активации макрофагов.

--

Молозиво GcMAF

  • Порошок и спрей используются для перорального введения. Молозиво Oral GcMAF разрешен в Японии как пищевой продукт.
  • GcMAF получают из молозива коровы
  • Капсула в 1 мг аналогична 100ng очищенного GcMAF
  • Кишечнорастворимая кислотоустойчивая капсула для перорального применения, порошок для подъязычного применения
  • Направлен на пейровы бляшки/ кишечник
  • Запатентованное производство
  • Разрешен в Японии как пищевой продукт
--

Рекомбинантный GcMAF

  • Новый GcMAF 4 поколения, произведен по технологии рекомбинации генов
  • Рекомбинантный GcMAF характеризуется той же молекулярной структурой, что и GcMAF первого поколения
  • Не требует крови для производства GcMAF
  • Станет хорошим лекарством

Рекомбинатный GcMAF был разработан в 2016.

Новый GcMAF 4 поколения, произведен по технологии рекомбинации генов.

Рекомбинантный GcMAF характеризуется той же молекулярной структурой, что и GcMAF первого поколения

Не требует крови в качестве стартового материала для производства GcMAF.

Станет хорошим лекарством.

Сравнение концентрации 3 типов GcMAF

GcMAF первого поколения
GcMAF первого поколения
GcMAF второго поколения
GcMAF второго поколения
Молозиво MAF
Молозиво MAF
  • Молекулярный вес GcMAF составляет 52-58 кДа
  • GcMAF второго поколения показывает 4 положительных фагоцита, 55 кДа протеиновый фагоцит представлен как основной компонент GcMAF
  • Молозиво MAF показывает три положительных фагоцита - 28 кДа фагоцит соответствует 52-58 кДа фагоциту GcMAF.
  • GcMAF второго поколения показывает 4 положительных фагоцита, 70, 55, 51 и 17 кДа. 55 кДа фагоцит подтвержден как GcMAF, который является главным компонентом.
  • Молозиво GcMAF показывает три положительных фагоцита, 180, 75 и 28 кДа. 28 кДа фагоцит соответствует GcMAF.

Поэтому GcMAF второго поколения и молозиво GcMAF могут включать другие факторы активации макрофагов. Мы продолжаем наши исследования.

Сравнение концентрации 3 типов GcMAF

На данном графике показано сравнение трех типов GcMAF в клиническом применении. GcMAF первого поколения показывает более низкую концентрацию за счет процесса очистки. Без альбумина и мочевой кислоты, (очищенный) химически изолированный GcMAF гораздо менее стабилен.

 

Фагоцитарная активность GcMAF

На данном видео показано, как макрофаги, активированные GcMAF второго поколения, поглощают овечьи эритроциты

GcMAF может активировать перитонеальные макрофаги мыши.

Пероральное молозиво GcMAF - фагоцитарная активность

На данном видео показано, как макрофаги, активированные при помощи перорального молозива GcMAF поглощают овечьи эритроциты.

Согласно доктору Уто из университета Токушима, пероральное молозиво Пероральное молозивоGcMAF обладает несколько большей способностью к активации макрофагов, чем инъекция GcMAF на перитонеальные макрофаги мыши.

Молозиво MAF выполняет по сути те же функции, что и GcMAF второго поколения. Согласно исследованиям доктора Уто в университете Токушима, пероральное молозиво MAF обладает несколько более сильной способностью к активации макрофагов, чем  инъекция GcMAF.

Антиопухолевая активность GcMAF 1го поколения, исследованная в естественных условиях

На данной схеме показана антиопухолевая активность в естественных условиях GcMAF первого поколения – исследование, проведенное доктором Уто в Университете Токушима. Здесь Вы видите, что в сравнении с нелечебной группой, GcMAF первого поколения значительно замедляет рост  гепатоклеточной карциномы в естественных условиях.

Антиопухолевая активность GcMAF второго поколения У мышей с асцитной опухолью

На данной схеме показана антиопухолевая активность в естественных условиях для второго поколения GcMAF, у мышей с асцитной опухолью, исследование проводилось доктором Уто в Университетет Токушима. Это очень агрессивная модель рака.

Черная линия показывает группу с отсутствием лечения, зеленая пунктирная линия показывает группу, на которой испытывался GcMAFпервого поколения, а синяя пунктирная линия (с треугольниками) показывает группу GcMAF второго поколения. Здесь вы можете увидеть повышенное время выживания и срок жизни у мышей, прошедших лечение GcMAF второго поколения.

(у мышей с опухолью, для которых проводилось лечение при помощи второго поколения GcMAF срок жизни был больше до 138%). (Это очень значительное улучшение).